Obtención y purificación de la proteína Spike de SARS-CoV-2 - Chamba Valladolid, Jefferson Alexander (2023)
El proyecto de integración curricular va dirigido a la expresión y purificación de Spike (glicoproteína de SARS-CoV-2) mediante el sistema procariota Escherichia coli BL21, dado su uso terapéutico y de diagnóstico para tratar la Covid19, la bioproducción de Spike es necesaria hoy en día para uso investigativo de la mutación descontrolada del SARS-CoV-2. La expresión heteróloga comenzó con la clonación del plásmido pGBW-m4046865 en E. coli BL21 identificando las condiciones de cultivo óptimas para el desarrollo de la bacteria, posteriormente se realizaron ensayos de lisis celular para la extracción proteica y más adelante ser purificados mediante cromatografía de afinidad de níquel HisTrap y cromatografía de intercambio aniónico Sepharose Fast Flow. El medio adecuado para el crecimiento de E. coli BL21 recombinante fue Luria Bertani (LB) suplementado con 50ug/mL [Clor], 25 mM [Glu] a una temperatura de 37°C y agitación 210rpm, la inducción óptima se inició con un O.D 600 entre 0.5-0.6 a una concentración de IPTG de 0.5mM. La lisis celular se logró mediante el tampón 5%v/v (20mM TrisHCl, Triton X100 (1%v/v), 137mM NaCl, 50uM EDTA, pH7.4). Posteriormente, se aplicó cromatografía de intercambio aniónico (Sepharose Fast Flow) para eliminar trazas, residuos de lisis y ADN, seguidamente se purificó el producto por cromatografía de afinidad de níquel. Finalmente se expresó y purificó Spike con un tamaño de 62kDa en E. coli BL21 confirmando su presencia mediante SDS-PAGE a una concentración final de 2.53mg/mL. El proyecto es el inicio de una prueba de diagnóstico para detectar SARS-CoV-2, donde aún se pretende estandarizar un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima indirecto (iELISA), por ende, se prevé analizar los resultados con otros métodos como pruebas de caracterización de cuantificación (Bradford o BSA), Western Blot, además se puede determinar la inmunogenicidad de Spike en modelos animales.