Desarrollo y análisis del sistema conjunto pcr/dot blot para la detección del virus de la necrosis hipodérmica y hematopoyética infecciosa - Castro Lara, Jonathan Leonidas (2009)
Enfermedades causadas por virus, entre ellos el virus de la necrosis hipodérmica y hematopoyética infecciosa (IHHNV), se encuentran entre los principales causales asociados con la baja productividad en la industria de camarón. La implementación de técnicas de diagnóstico confiables es esencial para mejorar las estrategias de control de dichas enfermedades. El presente trabajo se destinó al desarrollo y análisis de un sistema conjunto de PCR/dot blot para la detección del IHHNV. La estrategia experimental se ejecutó en tres fases: 1) clonaje de regiones específicas del genoma viral para la generación del sondas nucleicas contra IHHNV, 2) optimización de un protocolo de PCR/dot blot para la detección del virus, y 3) evaluación del método optimizado de diagnóstico PCR/dot blot en la determinación de IHHNV en muestras de Penaeus vannamei. Las pruebas de sensibilidad y especificidad realizadas en fragmentos de ADN viral purificado mostraron valores de detección del dot blot (sin PCR) de hasta 3pg/µl, y ausencia de falsos positivos. El uso del conjunto PCR/dot blot permitió la detección de hasta 0.002ag/µl de ADN objetivo, comparado con una sensibilidad de 2ag/µl de la PCR sin dot blot. Este incremento en sensibilidad fue evidenciado durante la aplicación del protocolo PCR/dot blot al análisis de muestras de Penaeus vannamei. En una población de reproductores analizada, mediante PCR y PCR/dot blot, se encontró resultados positivos para el virus en un 69.83% y 79.9%, respectivamente; mientras que en una población experimental de juveniles los positivos estimados por ambas técnicas fueron 7.48% para PCR y 13.3% para PCR/dot blot. A más de incrementar el poder de detección de la PCR, el dot blot permitió el diagnóstico inequívoco de un número significativo de muestras cuyo análisis por PCR presentó resultados ambiguos. En base a estos resultados, el uso conjunto de PCR y dot blot como técnica de detección viral ofrece mayor sensibilidad y especificidad con respecto al diagnóstico basado solamente en PCR.