Identificación de genes expresados en plantas de banano: efecto de inoculación con mycosphaerella fijiensis morelet - Pacheco Coello, Ricardo Humberto (2014)
Se realizaron dos ensayos para determinar la interacción planta – patógeno en banano y sigatoka negra en el invernadero del CIBE - ESPOL, para lo cual se usaron dos variedades de banano resistente y una variedad susceptible a Mycosphaerella fijiensis Morelet. Cada ensayo se lo realizó en diferentes épocas y variedades. En el primero se evaluó la variedad ‘Calcutta 4’ (resistente) y la variedad ‘Williams’ (susceptible). Cada una fue inoculada con el hongo patógeno Mycosphaerella fijiensis Morelet. Se tomó las muestras de hojas número tres a los 6, 9, 12, 15 días post inoculación (dpi) usando nitrógeno líquido y luego fueron almacenadas a -80°C para los análisis moleculares. Luego de 15 dpi todas las plantas fueron evaluadas para determinar el grado de infección del M. fijiensis en las hojas dos y tres de acuerdo a Alvarado que es una modificación de la escala de Fullerton and Olsen. Para el segundo ensayo se usaron las Variedades ‘Tuu Gia’ (resistente) y ‘Williams’ (Susceptible), a diferencia del primer ensayo el objetivo de este solo fue para determinar el grado de infección del patógeno a partir de los 15 dpi. Antes de la inoculación primero se obtuvo una suspensión de conidios con cepas de M. fijiensis provenientes del banco de cepas del CIBE - ESPOL, las cuales fueron recolectados en distintas provincias del país. Las muestras de hojas recolectadas sirvieron para los análisis moleculares, mediante la extracción de ARN, síntesis de ADNc, y la PCR semi- cuantitativo. A los 26 días después de la inoculación se recolectaron muestras de 1 cm2 para realizar un conteo de estomas penetrados por el hongo patógeno; observándose que existen diferencias significativas en la hoja tres entre ‘Calcutta-4’ y ‘Williams’. También se determinó la expresión de 19 genes mediante una RT-PCR. Se caracterizó la expresión de cuatro genes mediante una RT-PCR semicuantitativo, observando la relación de expresión entre la variedad inoculada resistente (‘Calcutta-4’) con su control (no inoculado); la muestra de la variedad resistente inoculada con la muestra de la variedad susceptible (‘Williams’) inoculada; la muestra de la variedad susceptible inoculada con su control. El análisis de RT-PCR semicuantitativo muestra una sobre expresión en los cuatro genes al llegar a los 15 dpi, en la relación de la muestra de la variedad resistente inoculada con la muestra de la variedad susceptible inoculada. Todos los genes se analizaron con herramientas bioinformáticas, en distintas bases de datos, realizando un blastx y blastn con secuencias de ADNc, en el cual se logró identificar el E – value del organismo del cual tiene mayor semejanza y así mismo la proteína a cual codifica.