Caracterización molecular de 249 accesiones del banco de germoplasma de caña de azúcar del CINCAE usando técnicas de amplificación al azar de ADN (AP-RAPDs) - Cedeño Castro, Karen Elizabeth (2006)
El presente trabajo de investigación planteó como objetivo principal la caracterización molecular de 249 variedades y clones que forman parte del Banco de Germoplasma de caña de azúcar del Centro de Investigaciones de Caña de Azúcar del Ecuador (CINCAE). La caracterización se realizó usando la técnica molecular de reacción en cadena de la polimerasa con primado arbitrario (AP-PCR). La metodología que se siguió para alcanzar el objetivo planteado consiste en la extracción de ADN, utilizando el protocolo de microextracción descrito por Doyle y Doyle (1990) modificado para las condiciones del laboratorio del CINCAE. La cuantificación y determinación de calidad se hizo por medio de minigeles al 0.8%, usando DNA Low Mass Ladder (Invitrogen, 10068-013) como marcador. Las muestras se migraron a 100 V o 60 mA por 25 min. y las fotos capturadas usando el fotodocumentador (UVP Biodoc-ItTM and VisiDoc-It Systems). Para la obtención de los perfiles RAPDs, se tomó como referencia el protocolo original de William et al. (1993) adaptado para caña de azúcar (Gómez, 2005). Para la amplificación se utilizó un termociclador marca Techne (Flexigene), seleccionando el programa con una desnaturalización inicial a 92 °C por 4 min, 40 ciclos de amplificación con desnaturalización cíclica a 92°C por 1 min, a la temperatura óptima de anillamiento del primer por 1 min y 2 min de elongación cíclica a 72 °C ; y una extensión final a 72 °C por 7 min. Los productos RAPD fueron separados mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa preparada al 1.5% en buffer TBE 1X, utilizando un marcador de referencia (1 Kb DNA Ladder Marker), a 120 V durante 2 horas y 20 minutos. Para visualizar los fragmentos amplificados los geles fueron revelados con Bromuro de Etidio y la imagen capturada por el sistema de fotodocumentación bajo luz ultravioleta (UVP Gel Documentation System). Las reacciones AP-PCR se realizaron empleando 29 iniciadores de la serie OP (Operon Technologies Inc.), que fueron seleccionados de acuerdo a polimorfismos definidos en otros trabajos en caña de azúcar. La información molecular en patrones RAPDs fue analizada mediante la cuidadosa inspección visual de los geles, codificándose en base binaria, donde 1 indica presencia y 0 ausencia de la banda de amplificación, dando origen al “Fingerprinting” para cada variedad. Con estos valores se calculó el coeficiente de distancia Jaccard (Crisci y López, 1983). La técnica AP-RAPD permitió amplificar un total de 413 bandas, de las cuales 154 bandas son polimórficas con un rango de peso molecular de 500-3900 pb. Considerando el número total de bandas amplificadas y polimórficas se obtuvo 37.29% de polimorfismo. Con el uso del software NTSYS pc, y seleccionando a Jaccard para encontrar los coeficientes de similitud y utilizando la opción UPGMA se generó un dendograma donde se identificaron 20 grupos representativos y un 33.3% de variedades no agrupadas. El promedio de similitud alcanzado por los genotipos es del 65.5%. Entre las variedades/clones en estudio se observaron accesiones con nombres/códigos repetidos, las cuales se debían identificar si eran duplicados o accesiones con nombres incorrectos. Los perfiles RAPDs mostraron porcentajes de similitud entre 63-100% entre éstas variedades. Los resultados del presente trabajo permitieron identificar la variabilidad genética de la Colección Universal del CINCAE, complementando los estudios realizados en la primera parte de la colección. Se establecieron grupos de variedades determinando cercanías y semejanzas de las mismas; además, se compararon datos moleculares con algunos datos morfológicos para identificar duplicados de variedades presentes en el Banco de Germoplasma. Esto ayudará a planificar mejor los cruzamientos a realizar y obtener las mejores combinaciones genéticas para seleccionar en forma eficiente los nuevos cultivares. Además, permitirá la formación de un banco de datos a nivel molecular de las variedades y clones presentes en la Colección Universal del CINCAE.