Implicación de Dot1 en la regulación de los orígenes de replicación en la levadura Saccharomyces cerevisiae, mediante Q-PCR

El presente estudio tuvo como propósito determinar la implicación de Dot1 en la regulación de orígenes de replicación durante la síntesis de DNA en Saccharomyces cerevisiae. En fase S del ciclo celular existen mecanismos de control llamados “checkpoints” que detectan daños y permiten su reparación, preservando la estabilidad genómica. Rad9 es una proteína mediadora del checkpoint de daños en el DNA (DDC; del inglés DNA damage checkpoint). No se conoce exactamente el mecanismo de activación, pero las modificaciones ᵧH2A-S129 y H3-K79me pueden ser reconocidas por Rad9, y participar en la activación de esta ruta. Resultados previos obtenidos en el laboratorio donde se desarrolló este trabajo, apuntan a que ᵧH2A-S129 está implicada en el DDC, aquí deseamos determinar si H3-K79me también controla la activación del DDC. Puesto que la metilación de la lisina 79 de la histona H3 es catalizada por la proteína Dot1, la ausencia de meH-K79 se asegura en células mutantes Δdot1. El estado activo/inactivo de los orígenes de replicación tardíos es regulado por el checkpoint de daños en la replicación (DRC; del inglés DNA replication checkpoint), pero en ausencia de Tof1 permite la intervención de Rad9. Cuando no hay problema en el avance de la replicación, los orígenes se activan secuencialmente de acuerdo a su programación (precoces – early/ tardíos - late). Sin embargo, si una vez iniciada la replicación se presentan problemas, se activa el checkpoint, se bloquea la progresión de las horquillas de replicación procedentes de orígenes activos, y se reprime la activación de los orígenes de replicación tardíos que todavía no han sido activados. Para confirmar la función reguladora de Dot1 se determinó el estado de activación de orígenes tardíos, en un mutante Δdot1 Δtof1. El estado de activación/inactivación de los orígenes de replicación se determinó mediante la técnica 2 copy number, que es una Q-PCR (Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa), dirigida a detectar los orígenes de replicación. La técnica 2 copy number puede discernir entre 2 unidades relativas de fluorescencia (origen activo) y 1 unidad relativa de fluorescencia (origen inactivo). La técnica se aplicó para estudiar 5 OR: 1 temprano, 4 tardíos y también una zona de control negativa. Los resultados muestran que células Δdot1Δtof1 son incapaces de reprimir orígenes de replicación tardíos, confirmando la función regulatoria de Dot1 en el DDC presumiblemente activando Rad9

• Váldodahkki: Vásconez Martínez, Jeanneth Karina (author)
• Materiálatiipa: bachelorThesis
• Giella: spa
• Almmustuhtton: 2017
• Fáttát: SACCHAROMYCES CEREVISIAE; MUTACIÓN; DNA; ESTABILIDAD GENÓMICA
• Liŋkkat: http://www.dspace.uce.edu.ec/handle/25000/13092