Efecto modulador de agonistas de GnRH en los procesos de adoptosis en las c?lulas de la granulosa del ovario de la gallina dom?stica
- Authors
- Revelo Cueva, Mar?a del Carmen
- Format
- MasterThesis
- Status
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- Description
La atresia folicular (reabsorci?n de un fol?culo ov?rico antes de alcanzar la madurez y la ovulaci?n) se inicia en la capa granulosa y es orquestada a trav?s de procesos de apoptosis (Tilly et al. 1991). El estudio de los mecanismos que controlan la apoptosis de la granulosa puede contribuir al mejor entendimiento de la fisiolog?a ov?rica de la gallina dom?stica. En los vertebrados los procesos apopt?ticos en la granulosa son regulados por varios factores (Johnson, 35690b). En esta regulaci?n participan hormonas esteroideas sexuales, factores de crecimiento, diversas citocinas y gonadotrofinas (Asselin et. al., 35690; Flores et. al., 35695). Adem?s, se ha comprobado que la hormona GnRH act?a regulando esteroidog?nesis ov?rica y ejerciendo efecto tanto estimulatorio como inhibitorio sobre la producci?n de hormonas esteroideas y apoptosis folicular (Ramakrishnappa et. al., 35695; Srivastava et. al., 1995). La GnRH tiene estas funciones autocrinas y/o paracrinas, gracias a la presencia de receptores en la granulosa, c?lulas luteales y c?lulas del epitelio superficial del ovario de los mam?feros (In-Sun Hong, 2011; Leung et. al., 35693; Ortmann & Diedrich, 1999). En la gallina dom?stica, no exist?a evidencia de la presencia del receptor de GnRH a nivel ov?rico y menos de la influencia directa de la hormona sobre los procesos apopt?ticos de granulosa de los fol?culos ov?ricos. Con el trabajo realizado se puso de manifiesto a trav?s de IHQ, que el receptor de GnRH tipo I se expresa en las c?lulas de la granulosa de los fol?culos pre-ovulatorios tanto en tejido ov?rico como en cultivo celular. Mediante el uso de un modelo in vitro con c?lulas de la granulosa derivadas de fol?culos pre-ovulatorios de gallinas dom?sticas se busc? evaluar si el agonista de GnRH, acetato de leuprolide (LA), era capaz de modular la apoptosis en estas c?lulas a trav?s de la uni?n directa con el receptor de GnRH tipo I. Para alcanzar este objetivo se obtuvieron en primera instancia cultivos primarios y a partir de ellos, c?lulas de la granulosa de gallina de pasaje 1 (CGG-P1) que se utilizaron como modelo experimental. Las c?lulas del pasaje I fueron capaces de crecer empleando medio de cultivo DMEN+F12 suplementado con 5% de SFB en un ambiente de 38,5?C y 5% de CO2. Bajo estas condiciones las c?lulas mostraron una curva de crecimiento cl?sica, alcanzando la confluencia celular a las 96 horas de cultivo. Las CGG-P1 se caracterizaron por presentar una morfolog?a fibrobl?stica y abundantes vacuolas citoplasm?ticas con contenido lip?dico. El an?lisis de la fase efectora de la apoptosis, a trav?s del estudio de la expresi?n de prote?nas de la familia Bcl-2 (Bax y Bcl-2), revel? la ausencia de modulaci?n de la apoptosis por parte del acetato de leuprolide, en la dosis 100 nM. De igual manera, no se encontr? variaci?n en la inmunomarcaci?n para la prote?na caspasa-3 activa; as? como tampoco en la expresi?n de la fosfatidilserina (determinada por la marcaci?n con AV/IP y analizado por FACS) entre los tratamientos, mostrando que LA 100 nM no modula el proceso de apoptosis temprana en las CGG-P1 provenientes de fol?culos pre-ovulatorios. Los resultados del estudio morfol?gico mediante tinci?n con hematoxilina demuestran que la inducci?n con acetato de leuprolide (LA) 100 nM no aumenta la proporci?n de cuerpos apopt?ticos en las CGG-P1 con respecto a los controles. El an?lisis morfol?gico empleando hematoxilina, e ICQ para Bax y caspasa-3 activa permiti? observar la fagocitosis de cuerpos apopt?ticos por parte de CGG-P1 viables, mostrando que en el sistema podr?an operar fen?menos de fagocitosis hom?loga. La evaluaci?n de la apoptosis tard?a mediante el empleo de la t?cnica TUNEL tampoco present? diferencias significativas entre tratamientos. A pesar, de esta ausencia de diferencias significativas entre las c?lulas tratadas con LA 100 nM y las cultivadas tan s?lo con 5% de SFB (control experimental), se encontr? un incremento en la fragmentaci?n oligonucleosomal de ADN frente a la inducci?n con per?xido de hidr?geno, confirm?ndose que el sistema es sensible a la inducci?n de la apoptosis, pero no con el agonista de GnRH estudiado, sino con su control positivo de fragmentaci?n de ADN. Sin embargo, considerando las particularidades del modelo en estudio no se descarta la modulaci?n del proceso de apoptosis por parte de otras isoformas GnRH y/o por la uni?n a otro tipo de receptor de GnRH, o bien sobre c?lulas de granulosa provenientes de otros tipos de fol?culos (fol?culos prejer?rquicos).
- Publication Year
- 2014
- Language
- spa
- Topic
- AVICULTURA
REPRODUCCI?N
C?LULAS DE GRANULOSA
APOPTOSIS
- Repository
- Repositorio SENESCYT
- Rights
- openAccess
- License
- openAccess